阿月浑子组织培养及快速繁殖技术
发布时间:2020-08-31 00:06
阿月浑子(PstaciaveraL )属漆树科黄莲木属,落叶小乔木,雌雄异株,是一种珍贵的木本油料和干果树种,其果实商品称“开心果”。目前,在我国仅新疆喀什疏附县有少量生产栽培,市场上大量供应的是从美国进口的“开心果”。由于缺乏种源、生长缓慢、繁殖和移栽困难等原因,至今未能广泛种植。因此,有必要对其进行组织培养快速繁殖的研究。有关阿月浑子组培的报道很少。为了满足生产单位对阿月浑子苗木的需求,在已有报道的基础上,采无菌种子的发芽幼苗,4~6a生树上的嫩枝,20~30a生雌、雄树上的嫩枝作外植体,研究了阿月浑子的组织培养及快速敏殖方法,获得了移栽成活的试管苗,为阿月浑子组培快速繁殖提供了科学依据。现将试验结果总结如下。 1 材料和方法 材料为新疆喀什市疏附县阿月浑子。研究所用无菌外植体获得方法有2种:第1种是无菌种子在试管内培养产生的无菌苗;第2种是春季直接从4~6a生幼树和20~30a结果雌树和雄树上,采集新萌生的嫩枝茎段、茎尖做外植体。诱导、增殖基本培养基,选用MS,附加6-BA、NAA、GA、LH、糖3%,选择阿月浑子试管苗诱导、增殖、壮苗培养条件,研究试管苗的生长繁殖规律。试管苗生根试验采用全量Ms,附加IBA、IAA、CH等方法来诱导生根。阿月浑子生根试管苗经炼苗后,称栽到河沙苗床中,统计生根率,观察幼苗和根系生长情况。阿月浑子试管苗培养温度22~30℃,光照培养时间10~12h/d,光照强度1000~2000lx,自然散射光培养或暗培养。 2 结果与分析 2-1 无菌外植体的获得无菌外植体获得有2种方法。第1种是种胚消毒后,接种到1/2MS、0 5%琼脂、不加蔗糖的培养基上。在25℃有光照的培养室内,种子发芽速度很快,10d后能长出带3~4片叶的小苗,15d后无菌苗能长4~6片单叶。此时,剪成茎段直接转入MS+6-BA4 0mg/L的诱导培养基中。接种13株,无菌成活9株,成活率为69 2%。通过这种方法能获得许多无菌材料,而且无菌苗不需要再灭菌,可直接转入分化培养基中。但是,用这种材料做植体,无法辨别雌雄株,给快繁苗木带来困难。这种外植体可以作为早期组织培养基础研究的材料。如果能利用生理生化的方法,如用同功酶分析技术,对无菌苗进行酶谱分析,找出雌雄同功酶的差别,可以鉴别出幼苗性别,这样就可以用无菌种子发芽做快速繁殖的材料。第2种是春季采集4~6a生幼树嫩枝和20~30a生的雌、雄树上的嫩枝材料,以幼嫩的茎尖和茎段为外植体,接种到诱导培养基上。经多次试验,接种成活率虽只有30%(主要原因是因为嫩枝切口产生出许多油脂类物质,升汞水溶液不能把材料表面完全湿润,达不到彻底灭菌的效果)。但这个成活率已能够为繁殖雌雄株阿月浑子提供足够的试验材料了。 2-2 丛生芽诱导用无菌种子诱导产生的无菌苗,剪成1~1 5cm长的茎尖和茎段(带1~2片单叶),接种到MS+6-BA4 0mg/L的诱导培养基上,30d后外植体腋芽萌发产生长1~4cm的新芽。将新产生的芽剪成长1~2cm继续进行第2代、第3代培养,可以获得能进行大量快速繁殖的丛生芽。在上述试验基础上,将阿月浑子20~30a生的雌、雄株嫩枝,接种到增殖培养基上,连续培养3代,获得丛生芽,培养结果见表1。从结果看出,6-BA4 0是诱导阿月浑子产生丛生芽的有效培养基,无论外植体来源于种子无菌苗,还是来源于幼树、雌树和雄树,都能诱导产生丛生芽。阿月浑子只有1a生幼苗是单叶,2a生以后幼树开始变成3~7片叶的奇数羽状复叶。试验所用幼树和雌、雄树的嫩枝外植体均是复叶材料。在阿月浑子树体上,腋芽自然萌发产生的都是复叶嫩枝,而在试管中复叶诱导产生的丛生芽,不仅仅是自然状态下腋芽萌发过程的重复,而是在细胞分裂素的作用下,从成熟的腋芽变成了生理幼态型的芽,产生出一种能够大量繁殖新类型的丛生芽。 2-3 不同激素条件下丛生芽的生长试验为研究阿月浑子试验苗增殖、壮苗等生长规律,研究了不同浓度的6-BA、NAA、GA、LH(水解乳蛋白)等物质对丛生芽生长的影响。 从试验结果可以看出:阿月浑子试管在6-BA0 5~4 0mg/L范围内,随着浓度的增高,腋芽萌发数量增加,丛生芽数增加,但茎尖坏死现象增多。如果在培养基中加入LH100mg/L,有利于芽的生长,对丛生芽的形成和幼芽的长高、长粗都有利。可以看出:GA能使幼芽长高,对形成丛生芽影响不大。根据上述试验结果和反复继代培养结果,确定阿月浑子增芽培养基为6-BA4 0mg/L,壮苗培养基为6-BA2 0mg/L,附加或不加LH100mg/L均可得到理想的结果。阿月浑子扩大增殖周期为30d,每代1瓶丛生芽,可有效增殖3~5倍,培养30d的丛生苗由30~40多个小芽组成。 2-4 阿月浑子的简化培养丛生芽实际上是由许多大小不等的无根苗组成的。既然是苗,如果在具有光照、空气和无机物的条件下,就应该能进行光合作用,能自己合成生长所需的各种有机物质。所用的MS培养基,是前人根据当时培养各种植物愈伤组织材料设计而成的。有许多物质在我们培养无根丛生苗时,并非是必需的。为此,进行了培养基中除去糖、有机物对丛生芽影响试验。可以看出:培养基中完全除去碳源———白砂糖,丛生芽第1代培养,生长速度极慢,没有新芽形成;第2代幼芽生长完全停止,并且开始不断死亡。这说明虽然丛生芽能进行少量光合作用,但远远不能满足幼苗分化增殖的能量需要。这个试验是在日光灯照强度2000lx条件下进行的。如果提高光照强度,在自然光培养,无根丛生苗是否能大量进行光合作用,来完全满足快速繁殖对碳源的需求,还需要在一定的条件下继续进行研究。阿月浑子丛生芽在长期培养过程中,在转管接种等过程中,会造成无菌苗被污染。其中有一种生长速度较慢的灰白色菌落细菌,对丛生芽危害较大,很容易造成大量交叉污染。这种细菌在前期数量较少时,对丛生芽生长没有影响。继续培养2~3代后,细菌的数量大增,使丛生芽逐渐死亡。试验用除MS有机成分(肌醇保留)的培养基接种被污染的丛生芽,结果丛生芽正常生长,细菌数量逐渐减少,结果见表5。原因是培养基中的VB1、VB6、烟酸等都是某些细菌生长的必需物质。除去这些有机物后,细菌无法生长发育,逐渐死亡减少。而植物有了碳源后,能合成自身生长所需要的一切物质。丛生芽是无根幼苗,具有这种自养能力,所以在培养基中除去有机成分后,能进行正常的增殖生长。用这种方法培养减少了试管苗的污染,取得了较好的结果,为在组培快繁中有效地控制污染找到了一条新的途径。 2 5 自然散射光培养和暗培养对丛生芽影响的试验为了降低试管苗培养成本,减少日光灯光照,充分利用自然散射光,研究了在不同光照条件下,试管丛生苗增殖生长的情况。从试验结果可以看出,试管苗在日光灯下和自然散射光下培养,丛生芽的增殖倍数、生长速度都正常。这一结果说明,在培养室日光条件较好的情况下,利用自然散射光照培养试管苗,同样可以得到良好的结果,而且降低了试管苗的培养成本。在完全黑暗条件下,丛生芽能正常生长、增殖,连续培养5~6代后,其繁殖倍数与光照条件下一致。而且将其较放置光照下培养后,幼苗又逐渐转变成绿色,叶片不断长大,完全恢复到光照下的绿苗状态。这说明黄化苗与绿苗之间可以相互转化。黄化苗叶片小,便于接种操作,暗培养可以降低试管苗成本。 2 6 试管苗的生根和移栽阿月浑子试管苗的生根试验结果列于表7。从表7可以看出,阿月浑子试管苗诱导生根很困难,都使用了高浓度的生长素,生根率才有明显提高。水解酷蛋白CH对诱导生根有利,能提高生根率和根系质量。另外,要提高生根率,关键是要培养叶片大,发育正常,茎段幼嫩、粗壮,高质量的试管苗。阿月浑子试管苗生根后,经自然光照锻炼,叶片转为深绿色,幼茎出现紫红色。从试管内取出,洗净琼脂块,移栽到双层苗床中。温度要求25~30℃,湿度在80%以上条件下,1个月后成活率达85%以上。阿月浑子试管苗移栽成活后,根系的生长速度远高于茎尖,而且幼苗的主根性很强。移栽成活的试管苗要采用容器育苗的方式,才能将试管苗成功地种植到苗圃中。 3 结论 3-1 本研究以成熟种胚或幼嫩的茎尖、茎段为外植体,可诱导出完整植株。其组织培养诱导丛生芽的增殖,每月繁殖有效倍数可达4倍,1a按繁殖10代计算,1个芽每年可增值410倍,达到很高的繁殖倍数。 3-2 阿月浑子在丛生芽培养过程中,始终有茎尖坏死现象。这在其他植物组培中还从未见到。一般是培养25d以后,生长得较高的嫩枝顶端茎尖开始坏死;下部幼茎生长良好,还能继续增殖,产生新的幼芽。茎尖坏死的幼苗叶片通常较小,发育不良,而幼苗生根后没有茎尖坏死现象。这一现象是阿月浑子组织培养的特殊现象,需要进一步从试管苗生理上进行研究。 3-3 阿月浑子试管苗生根率较低。其主要原因是受每个幼苗生理状况控制。这就要求选择叶片发育正常、茎段粗壮幼嫩的材料,这样才易生根。因为试验将生根的试管苗剪切后,继续进行增殖培养,结果生根率并没有提高。这说明同一丛生幼苗,各自的生理状况并不相同,而那些叶片发育正常,茎段粗壮幼嫩的材料很容易生根。所以要提高生根率,必须进一步研究试管苗生理状况,筛选出一个培养壮苗的培养基,为诱导生根提供合格的幼苗。